В ч 21003: Столовая в\ч 21003 — Мыс Шмидта

Содержание

Заказать оборудование для работы во взрывоопасных зонах

29003-06051    

Радиостанция портативная STP9038, 380-430MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF

29003-06061            

Радиостанция портативная STP9038, 380-430MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF, GPS, функция «Man-Down»

29003-06A61           

Радиостанция портативная STP9038, 380-430MHz, полная русифицированная клавиатура, цветной дисплей,1.8Watt RF, GPS, функция «Man-Down»

29013-06051

Радиостанция портативная STP9038, 380-430MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF, Bluetooth

29013-06061            

Радиостанция портативная STP9038, 380-430MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF, GPS, функция «Man-Down», Bluetooth

29023-06051

Радиостанция портативная STP9038, 380-430MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF, STProtect

29023-06061            

Радиостанция портативная STP9038, 380-430MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF, GPS, функция «Man-Down», STProtect

21003-06051    

Радиостанция портативная STP9040, 407-473MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF

21003-06061            

Радиостанция портативная STP9040, 407-473MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF, GPS, функция «Man-Down»

21003-06A51    

Радиостанция портативная STP9040, 407-473MHz, полная русифицированная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF

21003-06A61           

Радиостанция портативная STP9040, 407-473MHz, полная русифицированная клавиатура, цветной дисплей,1.8Watt RF, GPS, функция «Man-Down»

21013-06051    

Радиостанция портативная STP9040, 407-473MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF, Bluetooth

21013-06061            

Радиостанция портативная STP9040, 407-473MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF, GPS, функция «Man-Down», Bluetooth

21023-06061            

Радиостанция портативная STP9040, 407-473MHz, полная клавиатура, цветной дисплей, 1.8Watt RF, GPS, функция «Man-Down», STProtect

Фотообзор по сборке 21003 MOULD KING Tantive IV CR-90 Corellian Corvette от Bootlegbricks.ru

Рекомендуемые товары

21003 MOULD KING Tantive IV CR-90 Corellian Corvette

21003 MOULD KING Tantive IV CR-90 Corellian Corvette от официального дилера фабрики — интернет магазина конструкторов BOOTLEGBRICKS.RU. С..

13 300₽ 10 990₽

Пришлите фото сборки купленного в нашем магазине конструктора, стоимостью от 1000₽, и получите

дополнительную скидку до 10% при покупке следующего набора!

Дорогие друзья! Рады представить вам замечательный фото и видео обзор Лего конструктора (аналог) 21003 MOULD KING Tantive IV CR-90 Corellian Corvette, состоящий из 2905 деталей. Китайская фабрика MOULD KING производит по-настоящему качественные модели конструкторов Лего, в чем вы сейчас убедитесь.

В обзоре конструктора 21003 MOULD KING Tantive IV CR-90 Corellian Corvette вы найдете 63 фотографии

  • оригинальной коробки с разных ракурсов;
  • печатной инструкции набора и наклеек;
  • как упакованы детали;
  • как выглядят 2905 минифигурки, представленные в наборе;
  • сборки набора;
  • что получилось в итоге и как работает.

Понравился наш Лего обзор? Сделайте такой же на набор, у которого еще нет обзора и получите дополнительную скидку 10% на следующий заказ в нашем магазине БУТЛЕГБРИКС.ру!

Войсковые части Министерства обороны РФ

Колесников Андрей

Фадеева Виктория

Андрияш Дмитрий

Андрияш Дмитрий

Сиротин Дмитрий

Сиротин Дмитрий

Колесников Андрей

Ватченко Виталий

Андрей

Константин

Дючков Сергей

Herdt Viktor

Колесников Андрей

Константин

гунченко александр

Елькин Олег

Музыка Николай

Дмитрий Мазманишвили

uniofweb test

Колесников Андрей

Крылов Юрий

Богомолов Алексей

uniofweb test

колодиев Вячеслав

Андрей

Константин

Индекс /files/21003/21003-h/images

Название Последнее изменение Размер

2 9002_th.jpg Image28_th.jpg
Родительский каталог
Image01.jpg 2007-02 -17 19:35 314K
Image01_th.jpg 2007-02-17 19:37 44K
Image02.PNG 2007-02-17 20:05 6.0k
Image03.jpg 2007-02-17 20:02 309k
2007-02-17JPG 2007-02-17, 2007-02-17 2007-02-17 19:58 47k
Image06.png 2007-02-17 19:53 25K
JPG 2007-02-17 19:47 364K Image07_th.jpg 2007-02-17 19:49 38k
Image08.jpg 2007-02-17 19:45 282K
Image08_th.jpg 2007-02-17 19:46 51K
Image09.jpg 2007-02-17 19:42 311k
Image09_th.jpg 2007-02-17 19:43 29K
Image10.jpg 2007-02-17 19:39 157k
Image10_th.jpg 2007-02-17 19:40 43K
Image11.JPG 2007-02-17 20:29 210K 9003
Image11_th.jpg 2007-02-17 20:34 44K
Image12.jpg 2007-02-17 20:32 226K 900K
2007-02-19 11:28 42K
Image13.jpg 2007-02-17 20:31 313k Image13_th.jpg 2007-02-17 20:35 67k
2007-02-17 20:29 212K
Image14_th.jpg 2007-02-17JPG 2007-02-17 20:30 2007-02-17 2007-02-17 20:25 320K 900K
Image16_th.jpg 2007-02-17 20:26 44K
Image17.jpg 2007-02-17 2007-02-17 20:21 168k 9003
Image18_th.jpg 2007-02-17 20:21 54K
Image19.JPG 2007-02-17 20:18 164K
Image19_th.jpg 2007-02-17 20:19 34K
Image20.jpg 2007-02-17 20:16 227k
Image20_th.jpg 2007-02-17JPG 2007-02-17 23:51 138k 9003
Image21_th.jpg 2007-02-17 23:52 42k
2007-02-18 00:03 153k
Image22_th.jpg 2007-02-18 00:04 45K
Image23.JPG 2007-02-18 00:35 135K Image23_th.jpg 2007-02-18 00:35 32K
Image24.jpg 2007-02-18 00:50 148K 9003
Image24_th.jpg 2007-02-18 00:51 32K
Image25.JPG 2007-02-18 00:58 158K 9003
Image25_th.jpg _th.jpg 2007-02-18 00:59 47k
Image26.jpg 2007-02-18 01:08 245K
Image26_th.jpg 2007-02-18 01:11 29K
Image27.JPG 2007-02-18 01:13 346K 9003
Image27_th.jpg 2007-02-18 01:14 44K
Image28.jpg 2007-02-18 01:16 173k
2007-02-18 01:16 51K
Image29.JPG 2007-02-18 01:18 391K 9002K image29_th.jpg _th.jpg 2007-02-18 01:19 70k
Image30.jpg 2007-02-18 01:20 169k
Image30_th.jpg 2007-02-18 01:21 49k
Image31.JPG 2007-02-18 01:23 190K
Image31_th.jpg 2007-02-18 01:24 56k
Image32.jpg 2007-02-18 01:25 212K
Image32_th.jpg 2007-02-18 01:26 39K
Image33.JPG 2007-02-18 01:27 195k
Image33_th.jpg 2007-02-18 01:28 46K
Image34.jpg 2007-02-18 01:30 344k
Image34_th.jpg 2007-02-18 01:31 47K
Image35.JPG 2007-02-18 01:32 297k Image35_th.jpg 2007-02-18 01:34 45K
Image36.jpg 2007-02-18 00:01 172k
Image36_th.jpg 2007-02-18 00:02 51K
Image37.JPG 2007-02-17 23:46 316K 9003
Image37_th.jpg 2007-02-17 23:47 69K
Image38.PNG 2007-02-17 23:13 125k
Image38_th.png 2007-02-17 23:15 46K
Image39.JPG 2007-02-17 23:42 324K Image39_th.jpg 2007-02-17 23:44 49K
Image40.jpg 2007-02-17 23:37 225K
Image40_th.jpg 2007-02-17 23:38 45k
Image41.jpg 2007-02-17 23:33 190k
Image41_th.jpg 2007-02-17 23:35 60k
Image422.jpg 2007-02-17 23:30 28k 900K Image43.jpg 2007-02-17 23:25 185K
Image43_th.JPG 2007-02-17 23:27 23:27 34k Image44.jpg 2007-02-17 23:23 128k
Image444_th.jpg 2007-02-17 23:24 36K 9003
Image45.png 2007-02-17 23:21 14K
Image46.JPG 2007-02-17 23:17 162K
Image46_th.jpg 2007-02-17 23:19 43k
Image47.png 2007-02-2019 www.gutenberg.org Порт 80

Тетраплоидный фагл (21003)

Тетраплоидный фагл (21003)

USDA АРТИКУЛ №: 21003

ВЫБОР: Тетраплоид (2n = 40) разработан колхицином при лечении Fuggle (USDA 19209) в Корваллис, штат Орегон. В 1966 г.

РОД: гумус

ВИД: волчанка

КУЛЬТИВАР: тетраплоид Фуггл

РОДОСЛОВНАЯ: как Fuggle H, USDA 48209 или Fuggle (USDA 19209)

ОСНОВНОЙ ОБЪЕКТ: USDA коллекция зародышевой плазмы хмеля, OSU East Farm

ПРОИСХОЖДЕНИЕ: удвоение хромосомы лечение колхицином в 1966 г.

ДАТА ПОЛУЧЕНО: 1966

МЕТОД ПОЛУЧЕНО: выбор обрезков мягких пород древесины

В НАЛИЧИИ: без ограничений

НОМЕР: Хаунольд,.А., С.Т. Лайкенс и С.Э.Хорнер. Регистрация автотетраплоидного хмеля Fuggle T зародышевой плазмы (рег. номер GP 1) Crop Science 11: 945. 1971.

А. Хаунольд, Цитология, выражение пола и рост тетраплоидного x диплоидное скрещивание хмеля (humulus lupulus L) Crop Sci. 11: 868 — 871. 1971.

Хаунольд, А. Полиплоидная селекция с использованием хмеля (humulus lupulus L.). Мастер пивовар Ass’n of America, Tech. Ежеквартально 9: 36-40. 1972

СРОК СРОКА: рано

ЛИСТ ЦВЕТ: темный зеленый

СЕКС: женщина

БОЛЕЗНИ: Ложная мучнистая роса: устойчивый

Вертициллез увядание: умеренно восприимчив

Вирусы: неизвестно

Энергия: бедный

ВЫХОД: низкая (менее 1000 фунтов/акр)

БОКОВАЯ ДЛИНА РУКИ: 12 — 20 дюймов

АЛЬФА КИСЛОТЫ: 5% (5-летний диапазон: 3.от 7 до 5,8)

БЕТА КИСЛОТЫ: 2,4% (5-летний диапазон: от 2,0 до 3,0)

КОХУМУЛОНЕ: 26%

  ХРАНЕНИЕ СТАБИЛЬНОСТЬ: хорошая

МАСЛО: 0,93 мл/100 г (5 лет диапазон: 0,47 — 1,17)

ОСНОВНЫЕ ПРИЗНАКИ: тетраплоид, полезен для получения триплоидного хмеля.

ДРУГОЕ ИНФОРМАЦИЯ: женщина родитель триплоидных сортов Колумбия (USDA 21040) и Уилламетт (USDA 21041).

Топливный кран для трамбовки TR68 (1101-21003-4) – Tomahawk Power

Благодарим за покупку продуктов на www.tomahawk-power.com управляется Tomahawk Power, LLC.

Мы предлагаем полную гарантию возврата денег для всех покупок, сделанных на нашем веб-сайте с доставкой в ​​континентальную часть США. Если вы не удовлетворены продуктом, который вы приобрели у нас, вы можете вернуть свои деньги без вопросов. Вы имеете право на полное возмещение в течение 30 календарных дней с момента покупки.

Чтобы иметь право на возврат, ваш товар должен быть неиспользованным и находиться в том же состоянии, в котором вы его получили.Он также должен быть в оригинальной упаковке.

Некоторые виды товаров не подлежат возврату, включая товары, содержащие опасные материалы или легковоспламеняющиеся жидкости или газы.

Дополнительные товары, не подлежащие возврату: 
— Подарочные карты 
— Загружаемые программные продукты 

— Расширенная гарантия

 – Ускоренная доставка  

Для оформления возврата нам потребуется квитанция или подтверждение покупки.
Пожалуйста, не отправляйте покупку обратно производителю.

Существуют определенные ситуации, когда предоставляется только частичное возмещение (если применимо)
— Оборудование и детали с явными признаками использования
— Оборудование и детали, которые были открыты
— Любой предмет не в своем первоначальном состоянии, поврежден или отсутствует часть по причинам, не связанным с нашей ошибкой 
 – Любой товар, возвращенный более чем через 30 дней после доставки 

Возврат средств (если применимо)  
Полное возмещение стоимости вашей покупки зависит от полной проверки оборудования в авторизованном сервисном центре Tomahawk Power и /или представитель Tomahawk Power.Сумма возмещения за поврежденные предметы, недостающие детали, не в первоначальном состоянии или имеющие очевидные признаки использования по причинам, не связанным с Tomahawk Power или ошибкой продавца, может измениться из-за затрат на доставку и пополнение запасов.

Если вы одобрены, ваш возврат будет обработан, и кредит будет автоматически применен к вашей кредитной карте или исходному способу оплаты в течение определенного количества дней.

Задержка или отсутствие возврата средств (если применимо)  
Если вы еще не получили возмещение, сначала проверьте свой банковский счет еще раз.
Тогда свяжитесь с нами по адресу [email protected]

Вы можете связаться с компанией, выпустившей вашу кредитную карту, может пройти некоторое время, прежде чем ваш возврат будет официально отправлен. Далее обратитесь в свой банк. Часто перед отправкой возмещения требуется некоторое время на обработку.

Товары со скидкой и бывшие в употреблении (если применимо)  
Возврату подлежат только товары по обычной цене.

Обмен (если применимо)  
Мы заменяем товары только в том случае, если они неисправны или повреждены.Если вам нужно обменять его на такой же товар, отправьте нам электронное письмо по адресу [email protected] и отправьте товар по адресу: Tomahawk Power, LLC, 1405 30 th Street Ste F, Сан-Диего, , США. .

Подарки  
Если товар был помечен как подарок при покупке и доставке непосредственно вам, вы получите подарочный кредит на сумму вашего возврата. После получения возвращенного товара вам будет отправлен подарочный сертификат.

Если товар не был помечен как подарок при покупке, или даритель отправил заказ себе, чтобы передать вам позже, мы отправим возврат дарителю, и он узнает о вашем возврате.

Доставка  
Чтобы вернуть товар, отправьте его по почте по адресу: Tomahawk Power, LLC, 1405 30 th Street Ste F, Сан-Диего, , США. Для более тяжелого оборудования, требующего перевозки, рекомендуется сотрудничать с Tomahawk Power для координации отгрузки и предоставления соответствующей документации.

Вы будете нести ответственность за оплату собственных расходов по доставке для возврата вашего товара. Стоимость доставки не возвращается. Если вы получите возмещение, стоимость обратной доставки будет вычтена из вашего возмещения.

В зависимости от того, где вы живете, время, которое может потребоваться для того, чтобы ваш обмениваемый товар был доставлен к вам, может различаться.

Если вы отправляете товар на сумму более 75 долларов США, вам следует рассмотреть возможность использования отслеживаемой службы доставки или приобретения страховки доставки. Мы не гарантируем, что получим ваш возвращенный товар.

На товары, заказанные и отправленные за пределы континентальной части США, не распространяется полная гарантия возврата денег.

Если у вас есть дополнительные вопросы или вы хотите запросить возврат средств, свяжитесь с нами.

Генерация in situ большого количества генетических комбинаций для метаболического перепрограммирования посредством редактирования оснований под управлением CRISPR

Разработка метода BETTER

RBS представляет собой богатую G/A нуклеотидную последовательность, расположенную выше стартового кодона транскрипта мРНК, которая непосредственно настраивает экспрессию генов за счет зависимого от последовательности рекрутирования рибосом во время инициации трансляции белка 6 . Начиная с адаптированной RBS с восемью последовательными G, BETTER запрограммирован на создание библиотеки RBS, богатой G/A, для целевого гена посредством перехода C в T на комплементарной цепи (рис.1а). Максимальный размер библиотеки RBS для каждого целевого гена составляет 256 (G/A, 2 8 ) с учетом основного перехода C∙G → T∙A и может достигать 65 536 (G/A/C/T, 4 8 ) учитывая второстепенные C∙G → G∙C и C∙G → A∙T побочные продукты CBEs 12,13 . Используя превосходные возможности мультиплексного редактирования базовых редакторов 18,19 , BETTER может нацеливаться на десятки генов одновременно и создавать большое количество генетических комбинаций с разнообразными профилями экспрессии целевых генов.

Рис. 1: Общий рабочий процесс и проверка BETTER для создания генетических комбинаций и диверсификации экспрессии генов.

a BETTER перепрофилирует управляемый CRISPR слияние nCas9-цитидиндезаминазы для создания библиотек RBS, богатых G/A, из адаптированных исходных RBS с восемью последовательными G и получения вариантов клеток с разными фенотипами. b Одна гРНК приводит к преимущественному редактированию пяти G дистальнее PAM, в то время как две чересстрочные гРНК приводят к менее предвзятому редактированию восьми G.Набор PAM, gRNA и окно редактирования показаны одним цветом. Две буквы G, заштрихованные зеленым цветом, закрыты двумя окнами редактирования (синим и оранжевым). Три колонии использовали для редактирования оснований, и клетки смешивали в равных пропорциях перед экстракцией геномных ДНК, ПЦР-амплификацией и NGS. c Матрицы показывают покрытие и дискретность 256 G/A-содержащих вариантов RBS в библиотеках RBS, созданных BETTER с одинарными или двойными гРНК. KL-дивергенция использовалась для оценки дискретности генетических комбинаций.Масштабная линейка представляет log 2 (относительная пропорция). d Прочность библиотек RBS, созданных с помощью BETTER, анализировали на экспрессию GFP с помощью проточной цитометрии. В качестве контроля использовали сильный RBS (GAAAGGAG). Исходные данные, лежащие в основе рис. 1c, предоставляются в виде файла исходных данных.

Диверсификация экспрессии GFP с помощью BETTER

BETTER впервые был использован для диверсификации экспрессии репортера зеленого флуоресцентного белка (GFP) в C. glutamicum , основной рабочей лошадке в промышленной биотехнологии, используемой для производства примерно 70 природных и неприродных соединений. 20 .ДНК, кодирующая GFP, была интегрирована в хромосому с конститутивным промотором и адаптированным RBS GGGGGGGG (дополнительный рисунок 1). Ранее сконструированные плазмиды 18 инструмента редактирования базы Target-AID были сконструированы для экспрессии слияния никазы Cas9 (nCas9) и цитидиндезаминазы и гРНК, нацеленной на RBS. После трансформации плазмид и индуцированного редактирования оснований для изучения результатов редактирования оснований использовали целевое секвенирование следующего поколения (NGS). Для всех анализов NGS геномные ДНК ~10 9 клеток были извлечены и использованы в качестве матриц для амплификации области редактирования оснований.Ампликон секвенировали и анализировали примерно 100 000 прочтений на образец. Данные секвенирования выявили смещение редактирования в сторону пяти G дистальнее мотива, прилегающего к протоспейсеру (PAM) (рис. 1b), что согласуется с сообщенным окном редактирования с пятью основаниями редакторов цитидиновых оснований 13 . Чтобы покрыть проксимальные к PAM G и получить более равномерно распределенную библиотеку RBS, второй NGG PAM был вставлен рядом с первым и дополнительно экспрессирована вторая гРНК, чередующаяся с первой (рис.1б). Эта модификация улучшила тип генерируемых вариантов RBS с 94 до 202 из 256 комбинаций, содержащих G/A. Анализ расхождения Кульбака-Лейбле (KL) использовался для количественной оценки дискретности вариантов RBS, сгенерированных BETTER, и более низкое расхождение KL, предполагаемое распределение вариантов RBS, имело тенденцию быть более равномерным (рис. 1c и дополнительные данные 1). В случае расчета комбинаций, содержащих G / A / C / T, эта модификация улучшила тип вариантов RBS с 527 до 970 (дополнительные данные 1).Сила сгенерированных вариантов RBS составляла почти три порядка с точки зрения интенсивности флуоресценции GFP (рис. 1d), что сравнимо с таковыми у предыдущих библиотек промоторов на основе плазмид или устройств активации/интерференции CRISPR и достаточно велико для перепрограммирования клеточного метаболизма . 5,21,22 .

Тройная регуляция генов для перепрограммирования катаболизма ксилозы

Затем мы использовали BETTER для оптимизации пути катаболизма ксилозы, который является промышленно важным фенотипом для превращения лигноцеллюлозы 23 .Гетерологичный ген xylA из E. coli был впервые интегрирован в хромосому C. glutamicum с конститутивным промотором и адаптированным GGGGGGGG RBS для завершения пути (рис. 2a и дополнительная рис. 2). Два других важных гена для утилизации ксилозы, xylB и tkt , были выбраны в качестве мишеней BETTER и снабжены одними и теми же адаптированными RBS, что позволило трем мишеням использовать одну и ту же гРНК. До индукции экспрессии цитидиндезаминазы, управляемой CRISPR, наблюдались события редактирования с утечкой основания, более серьезные, чем редактирование одного сайта в RBS gfp , что может быть связано с увеличением количества сайтов редактирования (дополнительная рис.3). Чтобы уменьшить утечку экспрессии базового редактора и предвзятое редактирование некоторых нуклеотидов, мы использовали более слабый RBS, чтобы ослабить трансляцию цитидиндезаминазы, управляемой CRISPR (дополнительная рис. 4). Эта модификация привела к общему умеренному и менее предвзятому редактированию восьми G (рис. 2b и дополнительный рис. 3). Целевое секвенирование выявило G/A/C/T-содержащие типы RBS xylA , RBS xylB и RBS tkt вариантов, которые составили 3297 (включая A-213 G/содержащие типы), 5778 (включая типы, содержащие 239 G/A) и 3464 (включая типы, содержащие 229 G/A), в результате чего расчетная теоретическая максимальная сложность библиотеки составляет 6 × 10 10 (3297 × 5778 × 3464) (дополнительные данные 2) .

Рис. 2: Перепрограммирование катаболизма ксилозы с помощью BETTER.

a Путь катаболизма ксилозы. Три гена-мишени и соответствующие реакции выделены синим цветом. E4P эритрозо-4-фосфат, F6P фруктозо-6-фосфат, G3P глицеральдегид-3-фосфат, R5P рибозо-5-фосфат, Ru5P рибулозо-5-фосфат, S7P седогептулозо-7-фосфат. b Компоненты библиотек RBS до (0) и после шести пассажей (шестой) серийного культивирования в ксилозе. Три колонии использовали для редактирования оснований, и клетки смешивали в равных пропорциях перед экстракцией геномных ДНК, ПЦР-амплификацией и NGS. c Серийное культивирование для скрининга генетических комбинаций, способствующих росту на ксилозе. Цифры над столбцами представляют пассажи серийного культивирования. d Дискретность изменения генетических комбинаций при серийном культивировании. KL-дивергенция использовалась для оценки дискретности генетических комбинаций. e Матрицы показывают покрытие и дискретность 256 G/A-содержащих вариантов RBS в библиотеках RBS, созданных BETTER до (0) и после шести пассажей (шестой) серийного культивирования в ксилозе.Масштабная линейка представляет log 2 (относительная пропорция). Синие квадраты представляют обогащенный GAAAGGAA RBS xylA . f Варианты RBS с десятью наибольшими пропорциями для каждого пассажа серийного культивирования. g Утилизация ксилозы скринированным штаммом из шестого пассажа и рационально построенным штаммом с теми же RBS xylA , xylB и tkt , что и скринированный штамм. Значения и планки погрешностей отражают среднее значение ± s.д. из трех биологических повторностей ( n  = 3). Статистическую оценку (значение P ) проводили с помощью двустороннего теста t . NS недостоверный ( P  ≥ 0,05), n  = 3, h Прочность RBS, обогащенных при серийном культивировании в ксилозе с использованием хромосомного репортера GFP. Специально подобранный RBS (GGGGGGGG) и сильный RBS (GAAAGGAG) использовали в качестве контроля. Значения и планки погрешностей отражают среднее   ±   sd. из трех биологических повторностей ( n  = 3).Исходные данные, лежащие в основе рис. 2c–h, предоставляются в виде файла исходных данных.

После отверждения инструментальных плазмид отредактированную смесь клеток серийно культивировали для обогащения быстрорастущих вариантов с использованием ксилозы в качестве единственного источника углерода. Исходный штамм без редактирования базы также серийно культивировали в качестве контроля. После шести пассажей серийного культивирования рост отредактированной смеси клеток на ксилозе значительно улучшился (рис. 2в). Однако неотредактированный исходный штамм вообще не рос на ксилозе (дополнительный рис.5), что стало возможным из-за низкого уровня экспрессии ферментов, использующих ксилозу, с помощью адаптированного RBS GGGGGGGG (дополнительная рис. 6). Для отредактированной смеси клеток клетки собирали из каждого пассажа, и RBS для генов-мишеней анализировали с помощью NGS. Во время серийного культивирования значения расхождения KL для вариантов RBS увеличивались, что указывает на увеличивающееся неравномерное распределение вариантов RBS и обогащение некоторых вариантов RBS (рис. 2d, e). Детальный анализ показал, что RBS xylA GAAAGGAA, RBS xylB AAAAGGAA и RBS tkt GAAAGGAA стали доминирующими комбинациями RBS после шести пассажей серийного культивирования (рис.2b, дополнительный рис. 7 и дополнительные данные 3). Три варианта RBS были обогащены в 209, 52 и 13 раз соответственно и составляли более половины вариантов RBS в шестом пассаже (рис. 2f и дополнительные данные 3). Все четыре быстрорастущие одиночные колонии, отобранные из шестого пассажа, имели вышеупомянутые комбинации RBS. Удельная скорость роста и скорость поглощения ксилозы обогащенным штаммом достигали 0,26 ч -1 и 7,3 ммоль/гCDW ч соответственно (рис. 2g), что выше зарегистрированной максимальной скорости поглощения ксилозы C.glutamicum (5,7 ммоль/гCDW ч) 24 .

Чтобы исключить эффекты других неожиданных мутаций, накопленных в ходе серийного культивирования, исходные GGGGGGGG RBS xylA , xylB и tkt были заменены обогащенными комбинациями RBS в исходном штамме, который продуцировал штамм с такая же способность к утилизации ксилозы (рис. 2g). Результаты показывают, что улучшенное использование ксилозы происходит исключительно за счет изменений RBS. Используя хромосомный репортер GFP, обогащенные RBS (GAAAGGAA и AAAAGGAA) тестировали на эффективность трансляции.RBS GAAAGGAA и AAAAGGAA продемонстрировали в 35 и 13 раз более высокую эффективность трансляции по сравнению с исходной RBS GGGGGGGG. По сравнению с обычно используемым сильным RBS (GAAAGGAG), GAAAGGAA и AAAAGGAA RBS показали силу 157% и 59% (рис. 2h). Поскольку 5′-область кодирующей последовательности (CDS) также влияет на экспрессию генов 25,26 , мы непосредственно измерили активность ферментов, утилизирующих ксилозу, в исходном штамме с GGGGGGGG RBS и в скрининговом штамме с отредактированными RBS. Активность XylA, XylB, ant Tkt в неочищенных клеточных экстрактах увеличилась в 7 раз.0-, 5,8- и 10,4-кратно из-за изменений RBS (дополнительная рис. 6), что было интуитивно понятным и согласовывалось с предыдущими выводами о том, что использование ксилозы улучшилось за счет повышенной экспрессии катаболических генов ксилозы 9 . Результаты также предполагают, что один RBS может приводить к разным уровням экспрессии для разных генов-мишеней (например, gfp и катаболических генов ксилозы), возможно, из-за 5′-области CDS. В этом случае метод BETTER предпочтительнее для оптимизации экспрессии генов, поскольку он помогает напрямую отбирать оптимальные RBS для целевого гена.

Декупл-генная регуляция для перепрограммирования биосинтеза ликопина

Чтобы продемонстрировать применение BETTER для оптимизации более сложных метаболических путей, мы провели декупл-генную регуляцию для оптимизации метаболического потока через 1-дезокси-d-ксилулозо-5-фосфат (DXP). ) путь биосинтеза для сверхпродукции изопреноида, ликопина, в пути деградации ликопина, заблокированном штаммом C. glutamicum Δ crtY e/f Δ crtEb .Десять эндогенных генов ( DXS , DXR , ispD , ISPE , ISPF , ispG , ispH , crtE , crtB и crtI ) в ликопена пути биосинтеза были предназначен для метаболического перепрограммирования (рис. 3а). Поскольку некоторые гены пути DXP являются важными генами, невозможно удалить все десять исходных копий или даже заменить их RBS адаптированными GGGGGGGG RBS из-за его низкой эффективности трансляции (данные не показаны).Чтобы быстро вставить адаптированные гены-мишени GGGGGGGG RBS выше по течению, десять генов были организованы в три искусственных кластера и интегрированы в хромосому C. glutamicum . Искусственный DXS DXR DXR ISPD и ISPE ISPE ISPE ISPG ISPG ISPG ISPG ISPG Кластеры с адаптацией GGGGGGGG RBS были вставлены в регион CGP2 и гн UPP соответственно, как вторая копия. Искусственный кластер crtE crtB crtI с адаптированными RBS GGGGGGGG был вставлен между cgl0622 и cgl0627 для замены нативного кластера (рис.3а). Сконструированный предковый штамм продуцировал 0,61 мг/г CDW ликопина. С увеличением числа целевых генов дискретность генетических комбинаций, генерируемых BETTER, стала более важной для создания высококачественной библиотеки. Окно редактирования базы можно настроить с помощью укороченных или удлиненных гРНК 27 . Поэтому мы протестировали два набора комбинаций двойных гРНК: гРНК из 20 + 20 нт и гРНК из 20 + 18 нт (рис. 3b). ГРНК из 20 + 18 нуклеотидов приводили к более умеренному редактированию G со второго по четвертый, чем гРНК из 20 + 20 нуклеотидов (рис.3c и дополнительные данные 4). Затем мы объединили варианты RBS, созданные с помощью BETTER, с двумя наборами гРНК и наблюдали значительное снижение значений расхождения KL для всех десяти отредактированных RBS, что свидетельствует о более равномерном распределении вариантов RBS для каждого целевого гена (рис. 3d, e и дополнительные). Данные 4).

Рис. 3: Перепрограммирование биосинтеза ликопина с помощью BETTER.

a Путь биосинтеза ликопина и три искусственных кластера, снабженных конститутивными промоторами и модифицированными RBS GGGGGGGG.Десять генов-мишеней выделены красным цветом. CDP-ME 4-дифосфоцитидил-2-C-метил-d-эритрит, CDP-MEP 4-дифосфоцитидил-2C-метил-d-эритрит-2-фосфат, DMAPP диметилаллилдифосфат, FPP фарнезилдифосфат, GGPP геранилгеранилпирофосфат, HMBPP ( E )-4-гидрокси-3-метилбут-2-енилдифосфат, IPP изопентенилдифосфат, MEC 2C-метил-d-эритрит-2,4-циклодифосфат, MEP 2-C-метил-d-эритрит-4 -фосфат. b Схематическое изображение двух наборов комбинаций двойных гРНК и соответствующих окон редактирования.Две буквы G, заштрихованные зеленым цветом, закрыты двумя окнами редактирования (синим и оранжевым). c Компоненты библиотек RBS гена dxs , созданных BETTER с двумя наборами комбинаций двойных гРНК. Слияние представляет собой сумму вариантов RBS, сгенерированных двумя вышеупомянутыми событиями редактирования. Три колонии использовали для редактирования оснований, и клетки смешивали в равных пропорциях перед экстракцией геномных ДНК, ПЦР-амплификацией и NGS. d Изменение дискретности генетических комбинаций RBS ispE , сгенерированных BETTER с двумя наборами комбинаций двойных гРНК.KL-дивергенция использовалась для оценки дискретности генетических комбинаций. e Матрицы показывают охват и дискретность 256 G/A-содержащих вариантов RBS ispE в библиотеках RBS, созданных BETTER с двумя наборами комбинаций двойных гРНК. Масштабная линейка представляет log 2 (относительная пропорция). f Скрининг клеток гиперпродукции ликопина из библиотек, созданных BETTER. г Анализ продукции ликопина и силы RBS исходного штамма (штамм 0) и четырех проверенных штаммов с интенсивной красной пигментацией (штаммы 1-4).Силу RBS определяли с использованием хромосомного репортера GFP. Шкала шкалы представляет флуоресценцию GFP, нормализованную с OD 600 нм . Значения и планки погрешностей отражают среднее   ±   sd. из трех биологических повторностей ( n  = 3). Статистическую оценку (значение P ) сравнения между каждым проверенным штаммом и исходным штаммом проводили с помощью двустороннего теста t . *** P  < 0,001, n  = 3. Исходные данные, лежащие в основе рис. 3d, e, g, представлены в виде файла исходных данных.

Целевое секвенирование показало, что G/A/C/T-содержащие типы RBS составляют 3550 для dxs (включая 237 G/A-содержащих типов), 1873 для dxr (включая 221 G/A-содержащие типы), 1847 для ispD (включая 238 типов, содержащих G/A), 3061 для ispE (включая 237 типов, содержащих G/A), 1694 для ispF (включая 237 типов, содержащих G/A), 1666 для ispG (включая типы, содержащие 223 G/A), 1987 для ispH (включая типы, содержащие 236 G/A), 3386 для crtE (включая типы, содержащие 245 G/A), 2263 для crtB (включая типы, содержащие 236 G/A), и 1667 для crtI (включая типы, содержащие 231 G/A) (дополнительные данные 4).Было подсчитано, что теоретически максимальная сложность библиотеки может достигать 2,7×10 33 , если исследовать достаточно большую популяцию клеток. Скрининг вариантов, избыточно продуцирующих ликопин, проводили путем выделения колоний с интенсивной красной пигментацией на минимальной среде CGXII с добавлением глюкозы (рис. 3f). Варианты были выделены примерно из 1 × 10 5 колоний, и некоторые из них продуцировали в 4,8 раза больше ликопина по сравнению с исходным штаммом (рис. 3g). В аналогичных экспериментальных условиях наш самый высокий выход ликопина, равный 2.9 мг/гCDW лучше, чем задокументированный показатель продукции ликопина C. glutamicum из глюкозы (2,4 мг/гCDW) 28 .

Целевое секвенирование выявило богатое разнообразие RBS в четырех вариантах с повышенной продукцией. Хотя в текущем эксперименте не было выявлено последовательного паттерна экспрессии для десяти генов биосинтеза ликопина, мы заметили, что crtI , катализирующий последнюю стадию биосинтеза ликопина, контролировался сильным RBS (GAAAGGGG) во всех четырех сверхпродуцентах (рис.3g и дополнительные данные 5). Это говорит о том, что превращение фитоена в ликопин может быть стадией, ограничивающей скорость. Поскольку доля GAAAGGGG занимала шестое место в библиотеке RBS crtI , созданной BETTER, и демонстрировала самую высокую силу трансляции среди шести RBS с наибольшей долей, она легко обогащалась, когда высокоуровневая экспрессия crtI улучшала ликопин. биосинтез (дополнительный рисунок 8). Интересно, что в трех из четырех сверхпродуцирующих вариантов (штаммы 2–4) вторая копия dxr и ispD отсутствовала в искусственном кластере на хромосоме, что может быть вызвано многосайтовыми одноцепочечными расщеплениями nCas9. .А четвертый вариант с перепроизводством (штамм 1) имел очень слабую RBS для dxr (рис. 3g и дополнительные данные 5). Таким образом, мы пришли к выводу, что слишком высокая экспрессия dxr и ispD может снижать выработку ликопина, и их оригинальных копий на хромосоме C. glutamicum достаточно. Затем мы сверхэкспрессировали dxr и ispD через плазмиду в штаммах 2 и 4 и наблюдали ожидаемое снижение титра ликопена (дополнительная рис.9), что подтвердило нашу гипотезу. Для пути биосинтеза белки, экспрессируемые на субоптимальных уровнях, могут привести к проблемам, таким как белковая нагрузка, накопление токсичных промежуточных продуктов или метаболический дисбаланс 29 . Предполагается, что сверхэкспрессия dxr и ispD может перегружать организм хозяина и в этом случае негативно влиять на биосинтез ликопина. Чтобы убедиться, что улучшение биосинтеза ликопина происходит исключительно за счет редактирования RBS, мы воссоздали штаммы 2 и 4 из штамма дикого типа.Было проведено три раунда гомологичной рекомбинации для вставки трех искусственных кластеров с отредактированными комбинациями RBS. Реконструированный штамм 2 продемонстрировал почти такую ​​же способность к выработке ликопина, что и проверенный штамм 2, в то время как восстановленный штамм 4 продуцировал немного больше ликопина, чем проверенный штамм 4 (дополнительная рис. 10). Результаты показывают, что инженерия RBS преимущественно приводит к изменению фенотипа. Оптимизированный путь биосинтеза DXP потенциально может производить другие полезные изопреноиды 30 .

Применение BETTER для диверсификации 5′-UTR и промотора

Помимо RBS, промотор и 5′-UTR между RBS и стартовым кодоном трансляции также играют важную роль в контроле экспрессии генов 25,26 . Чтобы расширить применение BETTER для диверсификации других элементов трансляции или транскрипции, мы протестировали конструкцию библиотеки для 5′-UTR между RBS и стартовым кодоном и блоком -35 промотора. Хромосомная кассета экспрессии gfp в C.glutamicum был модифицирован для замены исходной последовательности 5′-UTR с TTGAGA на шесть последовательных C, которые могли быть отредактированы базовыми редакторами для создания библиотеки, богатой C/T (рис. 4a). Здесь не было выбрано построение богатой G/A библиотеки, инициированной из последовательных G, чтобы избежать ее помех восходящему RBS. Поскольку ниже целевого Cs нет доступного NGG PAM, мы ввели синонимическую мутацию (GGA в GGG) для создания GGG PAM. Поскольку целевые Cs не находятся в окне редактирования инструмента редактирования базы Target-AID (позиции от −20 до −16, считая PAM как позиции 1–3) 13 , мы использовали инструмент редактирования базы BE3 12 с увеличенное окно редактирования в C.glutamicum (положения от -19 до -11) 31 , чтобы покрыть целевые шесть Cs в 5′ UTR (рис. 4a). После базового редактирования была создана библиотека 5′-UTR, богатая C/T. Поскольку ингибитор урацил-ДНК-гликозилазы был включен в состав BE3, наблюдалось небольшое количество превращений C в G и C в A (рис. 4b). Хотя C, дистальный к PAM, редактировался менее эффективно, все 64 комбинации, содержащие C/T, были обнаружены с помощью NGS (дополнительные данные 6). Дискретность вариантов 5′-UTR, сгенерированных BETTER, оценивали с использованием анализа дивергенции KL и относительно низкого значения 1.Было получено 98 (дополнительный рисунок 11). Всего было обнаружено 772 из 4096 видов комбинаций, содержащих G/A/C/T (дополнительные данные 6). Анализируя экспрессию GFP с помощью проточной цитометрии, было обнаружено, что отредактированные клетки демонстрируют различные сигналы флуоресценции GFP (рис. 4b).

Рис. 4: Диверсификация 5′-UTR и промотора с помощью BETTER для регуляции экспрессии генов.

a Дизайн мишеней редактирования основания путем замены исходной 5′-UTR между RBS и стартовым кодоном и блоком -35 промотора на шесть последовательных C соответственно.Целевые C подчеркнуты. Последовательности N20 гРНК обозначены пунктирной рамкой. PAM для 5′-UTR и редактирования промотора закрашены синим и фиолетовым цветом соответственно. Мутированный G для генерации GGG PAM выделен желтым цветом. Исходная последовательность экспрессионной кассеты gfp показана на дополнительном рисунке 1. b , c Анализ библиотек 5′-UTR (b ) и -35 box (c ) с помощью NGS и проточной цитометрии . Три колонии использовали для редактирования оснований, и клетки смешивали в равных пропорциях перед экстракцией геномных ДНК, ПЦР-амплификацией и NGS.Оригинальную экспрессионную кассету gfp использовали в качестве положительного контроля.

Для регуляции экспрессии генов путем редактирования промотора исходный блок промотора -35 P 11F , используемый для экспрессии gfp на хромосоме C. glutamicum , был заменен с TGGCAA на шесть последовательных Cs. Доступный AGG PAM ниже по течению от целевого Cs позволил прямое приложение BETTER с использованием инструмента редактирования базы Target-AID (рис. 4a). Базовое редактирование, ориентированное на шесть C, также привело к созданию всех 64 комбинаций, содержащих C/T, со значением расхождения KL, равным 1.95 (дополнительный рис. 11). Всего было обнаружено 900 комбинаций, содержащих G/A/C/T (дополнительные данные 6). Выходы флуоресценции GFP отредактированных клеточных культур были разнообразными, как и ожидалось (рис. 4c). Результаты показывают, что метод BETTER можно также использовать для диверсификации экспрессии генов путем создания библиотек для других элементов трансляции или транскрипции, отличных от RBS, таких как 5′-UTR и промотор.

Применение BETTER в

B. subtilis

Для дальнейшей проверки общей применимости метода BETTER к микроорганизмам, отличным от C.glutamicum , метод был распространен на другую модельную бактерию B. subtilis 32 , для которой мы недавно разработали эффективную технологию редактирования базы 33 . B. subtilis широко используется для биопродукции антибиотиков, витаминов и белков, тогда как его геномная инженерия сложнее, чем генетически поддающиеся обработке хозяев, такие как E. coli 33 . GFP был впервые использован в качестве репортера для тестирования метода BETTER. Кассета экспрессии, состоящая из конститутивного промотора, адаптированного GGGGGGGG RBS и gfp , была интегрирована в B.subtilis хромосома (дополнительный рисунок 12). Для создания библиотеки RBS использовали ранее сконструированную плазмиду 33 инструмента редактирования базы Target-AID, экспрессирующую каталитически мертвый гибрид Cas9 (dCas9)-цитидиндезаминазу и две переплетенные гРНК, нацеленные на RBS (рис. 5a). Анализ NGS предполагает, что все восемь G были отредактированы. Сила созданной библиотеки RBS, богатой G/A, охватывала почти три порядка с точки зрения интенсивности флуоресценции GFP (рис. 5b), демонстрируя хорошие характеристики BETTER в B.субтилис . Детальный анализ показывает генерацию 230 из 256 G/A-содержащих вариантов RBS со значением KL-дивергенции 1,87 (рис. 5в), а число увеличивается до 3519 в случае расчета G/A/C/T- содержащие варианты RBS (дополнительные данные 7).

Рис. 5: Регуляция экспрессии gfp и перепрограммирование катаболизма глицерина с помощью BETTER в B. subtilis .

a Две чередующиеся гРНК облегчают редактирование восьми G. Набор PAM, gRNA и окно редактирования показаны одним цветом. b Анализ библиотеки RBS gfp с помощью NGS и проточной цитометрии. Три колонии использовали для редактирования оснований, и клетки смешивали в равных пропорциях перед экстракцией геномных ДНК, ПЦР-амплификацией и NGS. В качестве контроля использовали сильный RBS (AGGAGGCG) 39 . c Матрица показывает покрытие и дискретность 256 G/A-содержащих вариантов RBS в библиотеке RBS gfp , созданной BETTER с двойными гРНК.Масштабная линейка представляет log 2 (относительная пропорция). KL-дивергенция использовалась для оценки дискретности генетических комбинаций. d Нативный путь катаболизма глицерина B. subtilis (черные стрелки) и гетерологичный путь Klebsiella sp. (синие стрелки). G3P глицеральдегид-3-фосфат, DHA-дигидроксиацетон, DHAP-дигидроксиацетонфосфат, glpF Bs глицериновый модификатор из B. subtilis ; glpK глицеролкиназа, glpD дегидрогеназа G3P, glpF Ks глицериновый посредник из Klebsiella sp., dhaD глицеролдегидрогеназа, dhaK дигидроксиацетонкиназа. e Матрицы показывают покрытие и дискретность 256 G/A-содержащих вариантов RBS в библиотеках RBS glpF Ks , созданных BETTER до (0) и после десяти пассажей (десятый) серийного культивирования в глицерин. Масштабная линейка представляет log 2 (относительная пропорция). Синие квадраты представляют собой обогащенные RBS glpFKs GAGGGAGA.Матрицы для библиотек RBS dhaD и dhaK показаны на дополнительном рисунке 14. Три колонии использовались для редактирования основания, и клетки смешивались в равных пропорциях перед экстракцией геномной ДНК, ПЦР-амплификации и NGS. f Компоненты библиотек RBS до и после десяти пассажей серийного культивирования в глицерине. г Серийное культивирование для скрининга генетических комбинаций, способствующих росту на глицерине. Цифры над столбцами представляют пассажи серийного культивирования.Для первых шести пассажей перенос производили после 22-часового культивирования. Для последующих четырех пассажей время культивирования для каждого пассажа было сокращено до 12 часов, поскольку скорость роста клеток значительно увеличилась. h Рост (закрашенные символы) и потребление глицерина (незакрашенные символы) дикого типа B. subtilis 168 (черный квадрат), исходный штамм (оранжевый кружок) с гетерологичным glpF Ks , dhaD , и Гены DHAK , контролируемые GGGGGGGG RBSS, и экранированным штаммом (зеленый треугольник) из десятого прохода с RBS GLPFKAGA GAGGGAGA, RBS DHAD Aagggaaa, и RBS DHAK GTAGGGAA.Значения и планки погрешностей отражают среднее   ±   sd. из трех биологических повторностей ( n  = 3). Исходные данные, лежащие в основе рис. 5c, e, g, h, предоставляются в виде файла исходных данных.

Доказав применимость BETTER в B. subtilis , мы перепрограммировали путь катаболизма глицерина для ускорения утилизации глицерина в B. subtilis . Глицерин является основным побочным продуктом производства биодизельного топлива и многообещающим субстратом для биопроизводства 34 . Примечательно, что глицерин является не только природным источником углерода для B.subtilis , но также увеличивает биопродукцию некоторых ценных химических веществ (например, менахинона-7 и уридина) при использовании в качестве сырья для B. subtilis 35,36 . Гетерологичный путь катаболизма глицерина от эффективного утилизатора глицерина Klebsiella sp. M5a1 (ATCC BAA-1236) 37 был введен в B. subtilis 168 (рис. 5d). Местный путь катаболизма глицерина не был выбран для оптимизации, чтобы обойти регуляцию антитерминаторным белком GlpP 38 .Искусственный кластер, состоящий из конститутивного промотора P GAPDH + 39 , glpF Ks (кодирующий глицерин фасилитатор), dhaD (кодирование глицерин дегидрогеназа) и dhaK (кодирующий дигидроксиацетона киназа) из Klebsiella sp. был интегрирован в хромосому B. subtilis . Индивидуальный RBS GGGGGGGG был установлен выше каждого гена-мишени (дополнительная рис.13). Затем с помощью BETTER были созданы библиотеки RBS для трех гетерологичных генов. NGS-анализ отредактированных клеток предполагает успешную диверсификацию RBS по трем мишеням. Были обнаружены почти все 256 G/A-содержащих вариантов RBS, 254 типа для RBS glpFKs , 254 типа для RBS dhaD и 255 типов для RBS dhaK и Дополнительные данные 8). В случае подсчета вариантов RBS, содержащих G/A/C/T, типы RBS glpFKs , RBS dhaD и RBS dhaK вариантов составили 3,1909, 1 и 7,1709. , в результате чего предполагаемая теоретически максимальная сложность библиотеки составляет 1 × 10 11 (7 170 × 3 909 ×4 913) (дополнительные данные 8).

После отверждения инструментальной плазмиды отредактированную смесь клеток серийно культивировали в минимальной среде М9 с глицерином в качестве единственного источника углерода для обогащения вариантов с улучшенной способностью к использованию глицерина. Для первого пассажа культуре потребовалось 22 ч для достижения наибольшей биомассы. После шести пассажей серийного культивирования время культивирования сократилось до 12 часов, что свидетельствует об улучшении скорости роста клеток и обогащении штаммов, лучше утилизирующих глицерин (рис. 5g). NGS-анализ клеток до и после десяти пассажей серийного культивирования показывает, что RBS glpFKs GAGGGAGA, RBS dhaD AAGGGAAA и RBS dhaK GTAGGGAAA5f и дополнительный рис. 14). Две быстрорастущие одиночные колонии, отобранные из десятого пассажа, имели одинаковые вышеупомянутые комбинации RBS. Мы провели ферментацию одного проверенного штамма во встряхиваемой колбе, чтобы определить его улучшенную способность к использованию глицерина, используя штамм дикого типа и исходный штамм без редактирования основания в качестве контроля. Скорость роста и скорость использования глицерина у проверенного штамма, по-видимому, были выше, чем у контроля (рис. 5h). Улучшение демонстрирует применимость BETTER в метаболической инженерии B.субтилис .

TTC 21003-45 Резьба 5/8″-11, японская стандартная натяжная шпилька

TTC 21003-45 5/8″-11 резьба, японская стандартная натяжная шпилька | Траверс Инструмент

Похоже, в вашем браузере отключен JavaScript. Для наилучшего взаимодействия с нашим сайтом обязательно включите Javascript в своем браузере.

Нажмите на изображение, чтобы увеличить

Дополнительная информация
Марка ТТК
Модель № 21003-45
Стандарт ЯПОНСКИЙ # 40
Конус #40
Размер резьбы 5/8″-11
Уголок 45°
Диаметр ретенционного наконечника .590″
Сквозная охлаждающая жидкость
Тип Ручки фиксации шпилек для инструментов Caterpillar с V-образным фланцем
Отверстие или цельное Твердый
Длина от задней части фланца до конца фиксирующей шпильки 1,266 дюйма
Длина от задней части фланца до диаметра удерживающего наконечника .990″
Стойка 65 Да
Диаметр шейки шпильки .394″
Вес 0,1562 фунта.
Страна происхождения ИМПОРТ

Многие продукты для металлообработки содержат металлы, которые включены в последнее предупреждение в соответствии с Предложением 65.Воздействие элементов может быть вредным. Может вызвать рак и нанести вред репродуктивной системе.

Подробнее

Экономичная цена и отличное качество!

Характеристики
  • Все сопрягаемые поверхности прецизионно отшлифованы.
  • Закален для максимальной долговечности.
backgroundLayer 1backgroundLayer 1

Copyright © 2022 Travers Tool Co. Все права защищены.

21003 Сиэтл Спейс-Нидл | Брикипедия

Сиэтл Спейс-Нидл

Подтема(ы):

Серия Landmark


21003 Seattle Space Needle — набор для архитектуры, выпущенный в 2009 году.В набор входит модель Seattle Space Needle. Он был спроектирован чикагским архитектором Адамом Ридом Такером.

Описание

Набор включает 57 деталей для сборки Сиэтлской космической иглы, расположенной в Вашингтоне, США, без минифигурок, как и во всех наборах линейки Architecture 2009 года. Модель в основном состоит из деталей TECHNIC, но есть детали System для сборки крыши и подставки. Цвет набора светло-серый, включая черную подставку с надписью « Seattle Space Needle ».

Фон

Спейс-Нидл — смотровая башня в Сиэтле, штат Вашингтон, США. Это городская достопримечательность и считается символом Сиэтла. Он был построен в Сиэтл-центре для Всемирной выставки 1962 года, которую посетили более 2,3 миллиона человек. Почти 20 000 человек в день пользовались его лифтами во время мероприятия.

Когда-то это было самое высокое сооружение к западу от реки Миссисипи. Его высота составляет 605 футов (184 м), ширина — 138 футов (42 м), а вес — 9 550 коротких тонн (8 660 тонн).Он построен, чтобы выдерживать ветер со скоростью до 200 миль в час (320 км / ч) и землетрясения силой до 9,0 баллов, такие же сильные, как землетрясение 1700 года в Каскадии. Он также имеет 25 громоотводов.

В Space Needle есть смотровая площадка на высоте 520 футов (160 м) и вращающийся (в настоящее время закрытый) ресторан SkyCity на высоте 500 футов (150 м). С вершины Иглы можно увидеть панораму центра Сиэтла, а также Олимпийские и Каскадные горы, горы Рейнир, Маунт-Бейкер, залив Эллиотт и окружающие острова.

Посетители могут добраться до вершины Спейс-Нидл на лифтах, которые движутся со скоростью 10 миль в час (16 км/ч). Поездка занимает 41 секунду. В ветреные дни скорость лифтов снижается до 8,0 км/ч. 19 апреля 1999 года городской совет по охране достопримечательностей присвоил ему статус исторической достопримечательности.

В сентябре 2017 года ресторан башни был закрыт в рамках реконструкции стоимостью 100 миллионов долларов. Ремонт включал в себя установку нового двигателя вращения и прозрачных стеклянных полов в пространстве ресторана, а также замену проволочного ограждения смотровой площадки на стеклянные панели.Пространство вновь открылось в августе 2018 года как Лупа, крытая смотровая площадка.

Примечания

  • Стоимость набора на веб-сайте LEGO в Великобритании составляет 17,99 фунтов стерлингов и 19,99 фунтов стерлингов.

LEGO.com Описание

Это описание взято с сайта LEGO.com. Пожалуйста, не изменяйте его. (посетите страницу продукта)

Спейс-Нидл в Сиэтле может стать вашим!

Постройте Сиэтл, знаменитую космическую иглу Вашингтона! Эта масштабная футуристическая башня, созданная для Всемирной выставки 1962 года, является четвертой в серии реальных строительных моделей LEGO Architecture Landmark.Построенный из серого кирпича, собранный Space Needle имеет высоту 8,7 дюйма (222 мм) на основании 3,1 дюйма (80 мм) с напечатанной этикеткой и включает в себя буклет с фактами о здании, его строительстве и истории. и творческий дисплей для вашего стола, книжной полки или каминной полки!

  • Копия реальной архитектурной достопримечательности Сиэтла Спейс-Нидл!
  • Буклет с подробной информацией о дизайне и истории! (только на английском языке)
  • Размеры 8,7 дюйма (222 мм) в высоту и 3.Ширина 1 дюйм (80 мм)!

Галерея

Внешние ссылки

Наши продукты | Высокопроизводительные автозапчасти HKS

Поршень φ86.5 доступен для КОМПЛЕКТА SR20DET 2.2L.
Пользователи могут выбирать между φ86,5 (ШАГ 1) и φ87,0 (ШАГ 2) для состояния блока цилиндров или требуемой спецификации двигателя.

9112

■ Характеристика

Смещение SR20 увеличивается со стока 1,998CC до 2139 куб.
Чем больше рабочий объем, тем больше крутящий момент. Это позволяет использовать его с турбинами большой пропускной способности.
*STEP2 φ87.0 составляет 2164 см3.

 

Поршень φ86,5 считается ШАГОМ 1 комплекта объемом 2,2 л. Обработка поверхности STEP2 (φ87.0) не выполняется для STEP1 для достижения доступной цены. Этот комплект также рекомендуется для капитального ремонта. Почувствуйте мощь 2,2 л.
*Хотя это STEP1, это кованый поршень. Кованый шатун и кованый коленчатый вал — это те же элементы, что и в ШАГЕ 2, что означает, что максимальная целевая мощность такая же.
*поршень φ87.0 — ШАГ 2. Он имеет более стойкое к ударам никелирование на верхней части поршня и обер-покрытие, снижающее трение, на юбочной части.

 

СДЕЛАНО В ЯПОНИИ (HKS собственного производства).

 
Поршень φ86,5 был недавно разработан как STEP1. Это прочный кованый поршень.
(ШАГ 2 имеет никелирование, обер-покрытие и верхнее кольцо с титановым покрытием.)

 

 

5) ИЛИ Step2 (Φ87.0)
87.0 8,3 высота коронки Объем кроны 15,3 9218 —
HKS 2.2LKIT STEP1 HKS 2.2LKIT STEP2
Kit Price (W / O налог)
Piston Bore ( ММ) 86.5 87.0 87.0
20014
2139 2 162210
Коэффициент сжатия (ε) прокладка1.2 мм 8,7 8,8
прокладка 1.6 мм 8,4 8,5
Gasket2.0mm 8.2
4,8 4,8
15,3
Топ покрытия никелирование
юбка на покрытие OBER покрытие
Замечание
Замечание / Кольцо масла: 2 Шт. / Верхнее кольцо: Титановое покрытие
/ Масляное кольцо: 2 шт.
Соединительные стержни То же самое → кованые H-балки соединительные стержни
коленчатый вал То же → Кованый полный счетчик коленвал

[Использование используемого блока цилиндров]

деформация, с 0.Растачивание и хонингование диаметром 5 мм могут не иметь точной окружности отверстия. (То же самое для других моделей двигателей.)
В случае, если отверстие не соответствует точной окружности, поршни не могут быть установлены точно. Поэтому рекомендуется ШАГ 2 φ87,0 с расточкой 1,0 мм и хонингованием.
φ87.0 STEP2 имеет никелированное покрытие, стойкое к ударам.

 

[Использование блока цилиндров нового или в хорошем состоянии]

Рекомендуется использовать φ86,5, чтобы можно было использовать φ87,0 для следующего капитального ремонта.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован.